| 靈芝對(duì)白介素-2（IL-2）產(chǎn)生的影響 |
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本文主要研究日本產(chǎn)靈芝對(duì)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的影響。結(jié)果表明在試管內(nèi)氫化考的松（HC）和環(huán)胞霉素（CsA）可抑制脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，靈芝10～100μg/ml可對(duì)抗其抑制作用，使IL-2產(chǎn)生增加。整體研究表明靈芝300mg/kg po.促進(jìn)脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，即使在有氫化考的松或環(huán)胞霉素A存在條件下，靈芝的作用依然明顯。
關(guān)鍵詞 靈芝；白介素-2（IL-2）
白介素-2（IL-2）是最重要的淋巴因子之一，具有多種生物學(xué)功能，不僅可以在試管內(nèi)使T細(xì)胞持續(xù)生存，而且在免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中也占重要地位。IL-2主要由T輔助細(xì)胞產(chǎn)生，所以IL-2的水平亦間接地反映了T細(xì)胞的功能[1]。已知靈芝可以作用于免疫系統(tǒng)影響多種免疫功能，本文旨在研究靈芝對(duì)脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的作用，進(jìn)而分析其對(duì)免疫系統(tǒng)的影響。
材料與方法
動(dòng)物
C57BL/6小鼠，8～12周齡；昆明種小鼠，16～20g。均由上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部供應(yīng)。
試劑
靈芝熱水提取物由日本和漢生藥研究所提供，按前述方法制備。
RPMI-1640培養(yǎng)基為GIBCO產(chǎn)品，含青霉素100μ/ml,鏈霉素100μg/ml,Hepes 15mmol及10%小牛血清（NCS）。刀豆蛋白（Con A）,Sigma產(chǎn)品。2-甲基-D-甘露糖苷（2-MM），上海試劑二廠產(chǎn)品。環(huán)胞霉素為瑞士三道士藥廠產(chǎn)品。靜脈注射用制劑每毫升含Cyclosporin A 50mg, Polyoxyethylated Castcr Oil 650mg及33%乙醇。
3H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），中國(guó)科學(xué)院原子核研究所生產(chǎn)，比活性為1110GBq/mmol。
在試管內(nèi)誘導(dǎo)IL-2產(chǎn)生
小鼠脾細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為５×106/ml，加入24孔培養(yǎng)板，與不同濃度靈芝及3μg/ml的Con A混合，37℃ 5% CO2中培養(yǎng)24h，取上清，離心，貯于-30℃，待測(cè)。
靈芝預(yù)處理脾細(xì)胞的作用
為消除在測(cè)定IL-2活性的培養(yǎng)上清中所含藥物的影響，部分實(shí)驗(yàn)作以下設(shè)計(jì)：脾細(xì)胞與靈芝或其他藥物共同培養(yǎng)10h，離心，棄上清液，細(xì)胞洗2次，重新加入Con A 3μg/ml，培養(yǎng)24h，收集各組上清液，離心，貯于-30℃，待測(cè)。
靈芝在整體對(duì)IL-2產(chǎn)生的影響
小鼠隨機(jī)分組。對(duì)照組口服0.2%CMCqd.×6。靈芝組分別口服靈芝150及300mg/kg,qd.×6,部分組靈芝合并應(yīng)用氫化考的松（HCip.qd.×6）或環(huán)磷酰胺（CYA）ip.qd.×3(d4～d6)。第7天小鼠處死取脾臟，調(diào)節(jié)脾細(xì)胞數(shù)如前，加ConA 3μg/ml,培養(yǎng)24h。取上清，貯于-30℃，待測(cè)。
IL-1活力測(cè)定
利用活化的脾細(xì)胞測(cè)定IL-2[2]。C57BL/b小鼠頸椎脫位處死，取脾，脾細(xì)胞經(jīng)溶紅細(xì)胞后洗3次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×106/ml，加入Con A 3μg/ml,37℃ 5% CO2中培養(yǎng)48h，收集此活化的脾細(xì)胞，以含20mg/2ml α-mm的RPML-1640洗2次以消除殘存Con A。臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×106/ml。將細(xì)胞濾液加入96孔板，每孔100μl。同時(shí)放入經(jīng)對(duì)倍稀釋的待測(cè)上清100μl，37℃ 5% CO2中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束前6h每孔加入3H-TdR 9.25kBq。以多頭細(xì)胞收集儀將細(xì)胞收集至醋酸纖維薄膜。測(cè)定結(jié)合的3H-TdR量。
結(jié) 果
氫化考的松的抑制作用
氫化考的松可以在試管內(nèi)抑制脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，經(jīng)用不同稀釋度的上清測(cè)定，證明在適當(dāng)稀釋度可以顯示其抑制效應(yīng)。
靈芝在試管內(nèi)對(duì)氫化考的松抑制作用的影響
表7-1，7-2表明HC 0.025～1μg/ml在試管內(nèi)明顯抑制脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2。靈芝可以對(duì)抗HC的抑制作用而恢復(fù)IL-2的產(chǎn)生。但靈芝本身在試管內(nèi)對(duì)脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2并無(wú)明顯影響。
表7-1 靈芝合并應(yīng)用氫化考的松在試管內(nèi)對(duì)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的影響
靈芝 Con A HC cpm/1×106細(xì)胞
μg/ml μg/ml μg/ml
對(duì)照 3 -- 2025±167
-- 3 0.025 1530±149
1 3 0.025 1409±183
10 3 0.025 2005±210
100 3 0.025 2205±335
表7-2 靈芝與氫化考的松在試管內(nèi)對(duì)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的影響
靈芝 Con A HC cpm/1×106細(xì)胞
μg/ml g/ml μg/ml
對(duì)照 3 -- 8389±658
-- 3 1 3944±262
1 3 1 4348±482
10 3 1 5396±260**
100 3 1 5450±426**
上清液稀釋度1∶16； X±SD； n=4; 與對(duì)照組比△△P<0.01,與HC組比 **P<0.01
靈芝與環(huán)胞霉素在試管內(nèi)對(duì)IL-2產(chǎn)生的影響
表7-3表明CsA 0.05μg/ml明顯抑制脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，靈芝可對(duì)抗CsA的抑制作用，增加脾細(xì)胞分泌IL-2。
表7-3 靈芝與環(huán)胞霉素在試管內(nèi)對(duì)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的影響
靈芝 Con A HC cpm/1×106細(xì)胞
μg/ml μg/ml μg/ml
對(duì)照 3 -- 8389±658
-- 3 0.05 5667±450
1 3 0.05 5763±395
10 3 0.05 6495±446**
100 3 0.05 6539±557**
上清液稀釋度1∶16； X±SD； n=4; 與對(duì)照組比△△P<0.01,與CsA組比 **P<0.05
靈芝對(duì)氫化考的松、環(huán)胞霉素預(yù)處理脾細(xì)胞的作用
為消除在被測(cè)上清中所含藥物對(duì)IL-2的測(cè)定可能產(chǎn)生的影響，將靈芝單獨(dú)，或合并HC或CsA與脾細(xì)胞共同培養(yǎng)10h，棄去培養(yǎng)液，細(xì)胞洗2次，加入含3μg/ml Con A的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h測(cè)定上清IL-2的活力。結(jié)果如，表7-4所示，靈芝10～100μg/ml的預(yù)處理對(duì)脾細(xì)胞無(wú)明顯影響。HC及CsA 0.05μg/ml預(yù)處理后使脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2減少，但靈芝可以恢復(fù)被HC或CsA抑制的作用而使脾細(xì)胞分泌IL-2增加。
表7-4 靈芝與氫化考的松預(yù)培養(yǎng)脾細(xì)胞10h對(duì)IL-2產(chǎn)生的影響
靈芝 Con A HC cpm/1×106細(xì)胞
μg/ml μg/ml μg/ml
對(duì)照 3 -- 34724±1702
10 3 -- 35157±949
100 3 -- 35178±1076
-- 3 0.05 24438±2004△△
1 3 0.05 21811±1639**
10 3 0.05 31751±1064**
100 3 0.05 33744±2850**
上清液稀釋度1∶16； X±SD； n=4; 與對(duì)照組比△△P<0.01,與HC組比 ***P<0.01
靈芝在整體對(duì)IL-2產(chǎn)生的影響
亦表明當(dāng)靈芝與HC 15mg/kg腹腔注射qd.×6及靈芝與CYA 40mg/kg腹腔注射qd.×3(d4～d6)合并應(yīng)用時(shí)，聯(lián)合靈芝組的小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2較單用免疫抑制劑者為高。雖然在當(dāng)時(shí)條件下HC與CYA單獨(dú)使用并未明顯抑制IL-2產(chǎn)生。這可能與TS和TH所受作用處于平衡狀態(tài)有關(guān)，但一旦加入靈芝，后者增強(qiáng)TH和產(chǎn)生IL-2的作用。即明顯顯示。
討 論
1976年Morgen報(bào)道在致分裂原刺激的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在一種因子，能維持激活后的T細(xì)胞在體外長(zhǎng)期生長(zhǎng)，該因子被稱為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子（TCGF），于1979年國(guó)際淋巴因子專題會(huì)議上被統(tǒng)一命名為IL-2[3]。鑒于IL-2在免疫調(diào)節(jié)中的重要地位，包括上調(diào)多種功能，提高NK細(xì)胞的活力，激活T殺傷細(xì)胞，介導(dǎo)B細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的活化，因此出現(xiàn)了新的假設(shè)以說(shuō)明T細(xì)胞的活化過(guò)程[4]，進(jìn)而導(dǎo)致治療腫瘤新思維、新措施的產(chǎn)生。由此考慮免疫調(diào)節(jié)劑間接過(guò)影響IL-2的產(chǎn)生而發(fā)揮作用是很自然的。
作者已報(bào)道靈芝能作用于免疫系統(tǒng)影響多種功能。本文的目的主要是觀察靈芝對(duì)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的影響。研究表明靈芝無(wú)論在試管內(nèi)及整體均可刺激脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2，它能對(duì)抗免疫抑制劑HC，CsA及CYA的作用，恢復(fù)受抑制的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的能力。臨床報(bào)道T細(xì)胞功能受抑的病人如晚期腫瘤，老年人，原發(fā)性或獲得性免疫缺陷病人的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-2的能力低下，給這種病人以促進(jìn)IL-2生成的藥物，理應(yīng)是有益的。靈芝的上述作用能否有助于說(shuō)明其臨床應(yīng)用的效果，值得進(jìn)一步探討。
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