| 中國靈芝概況及其化學成分 |
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中國的靈芝種類
靈芝屬于自然界分布的一類真菌生物。世界上唯獨中國古人最早認識、研究、藥用和信仰靈芝，并視為仙草和祥瑞之物。
我國大量的古籍、史料記載了靈芝，并反映在醫(yī)藥學、民間文學、宗教信仰、建筑藝術(shù)、古典哲學、生物分類及栽培等各個方面。古埃及和古希臘人崇拜蘑菇為“神物”，然而在人類發(fā)展史上所占的地位和產(chǎn)生的影響，卻遠遠不及靈芝。從公元前一世紀以來，靈芝經(jīng)歷了數(shù)千年的考驗，仍不失藥用功效，現(xiàn)在又成為科學家多方面研究應用的對象。我國有關(guān)靈芝悠久的歷史和豐富的種類資源，又成為國內(nèi)外關(guān)注的焦點。
一、古代有關(guān)靈芝種類的認識
中國古代對于靈芝的認識起源于《山海經(jīng)》中關(guān)于炎帝幼女“瑤姬”精魂化為“萄草”即靈芝的神話故事。后經(jīng)加工逐漸演變，更加富于神奇色彩。原來在《禮記·內(nèi)則》（公元前300年）中記述靈芝“無華而生者日芝木而 ”。在《爾雅翼》（公元前290年）記載“芝，瑞草，一歲三華，無根而生”。說明我國古人把靈芝看作不同于有根、莖、葉的植物。
《淮南子·山訓篇》（公元前139年）中說“紫芝生于山，而不能生于盤石之上”。屈原在《楚辭·九歌·山魂》（公元前290年）中講，“采三秀兮于山間，石磊磊兮葛蔓蔓”。東晉的葛洪在《抱樸子·內(nèi)篇》（340年）中說“夫芝菌者，自然而生。”這是對靈芝生態(tài)習性的描寫。古人在認識野生靈芝的基礎(chǔ)上又探索培養(yǎng)方法，于是在《仙經(jīng)》中有“五木種芝，芝生。”東漢王充在《論衡·初稟篇》中便有“紫芝之栽如豆”之說法。
《神農(nóng)本草經(jīng)》被認為是我國最早的一部藥物學著作，其中詳細記載了“六芝”即青芝、赤芝、黃芝、黑芝、紫芝。葛洪在他的《抱樸子》中著錄了五種芝草圖。尤其這位古代著名醫(yī)學家、道教人物，又潛心于探索服食芝類長生之法，撰寫了有關(guān)論著，雖然帶有宗教求仙的神秘色彩，但仍然對后世服食靈芝之功效產(chǎn)生了重要的社會影響。他的論著還促進了古代其他菌類的研究和應用。據(jù)說僅出自魏晉道教人物之手的芝草類專著估計約百種以上，這在世界菌類史也是罕見的。后來的《唐新修本草》（659年）被認為是我國古代記錄“六芝”類真菌重要的藥典。
對古籍中六芝的討論
靈芝從神話中的“瑤姬”化為“萄草”，又經(jīng)過深化而出現(xiàn)了“六芝”，經(jīng)歷了相當長的時間，在東晉之前古籍中沒有“靈芝”之說。“六芝”的出現(xiàn)無疑是古人對芝類認識的發(fā)展。吳譜等在《神農(nóng)本草經(jīng)》和葛洪的《抱樸子》中主要根據(jù)顏色劃分“六芝”。葛洪曰“赤者如珊瑚，白者如截脂，黑者如澤漆，青者如翠羽，黃者如紫金。皆光明洞察，如堅冰也”。葛洪又按質(zhì)地分“五芝，即石芝、木芝、肉芝、菌芝和草芝�！绷捍蘸刖霸凇侗静萁�(jīng)集注》中也是依據(jù)色澤不同論述“六芝”。明代李時珍則進一步從性味和藥效功能進行“六芝”分類。
時珍曰“芝類甚多，亦有花實者，本草惟以芝標名，然其種屬不可不識�！闭f明芝類眾多，“六芝”只能是對當時知道的靈芝按六類標名，而不是六種。既然如此分類便有其代表種。不過我們今天很難用現(xiàn)代真菌分類學觀點對每一類的代表種命以準確的拉丁學名。現(xiàn)在專家對“六芝”認識是一種群體概念，每一種所代表的一個群體。
中國科學院微生物研究所的趙繼鼎教授曾多年從事靈芝等多孔菌的分類學研究，他根據(jù)《本草綱目》和《別錄》中對“六芝”的記載，應用現(xiàn)代已知有關(guān)種做了對比分析如下
1.青芝，又名龍芝。他認為云芝（Coriolus versicolor）可能是青芝。此種真菌蓋革質(zhì)，表面有絨毛，色彩變幻，這與《抱樸子》中講的青芝如翠羽有相似之處，又具有藥用價值。
2.赤芝，又名丹芝。認為赤芝便是今天熟悉的靈芝（Ganoderma lucidum）。類似赤芝的還有松杉靈芝（G. tsugae）等。其菌蓋表面褐黃色，褐紅色，具油漆光澤，又有一個表面光滑的菌柄。
3.黃芝，又名金芝。根據(jù)《抱樸子》記載黃者如紫金，大者十余斤，小者三四斤，凡求芝草入名山，必以三月九月。他認為是硫黃多孔菌（Laetiporus sulphureus），此種肉質(zhì)，黃色，老后變硬而脆。
4.白芝，又名玉芝。根據(jù)白色等特點，他認為可能是苦白蹄即藥用層孔菌（Fomitopsis offcinalis）。此種形如馬蹄，可達數(shù)斤，生松等針葉樹上，亦可藥用。
5.黑芝，又名玄芝。認為黑芝可能是假芝（Amauroderma rugosum）。此種菌蓋黑色，新鮮時傷處變血紅色，具黑色長柄。認為也可能是黑柄多孔菌（Polyporus melanopus），也是黑蓋和黑色長柄。
6.紫芝，又名木芝。認為紫靈芝（中國靈芝）（G. sinense）。此種菌蓋褐色，紫黑色至近黑色，菌肉均為褐色至栗褐色，并具長的菌柄。
對于“六芝”趙繼鼎先生是按照我國目前已知靈芝科的種和一些不屬于本科的多孔菌作了初步考證。如果我們根據(jù)“本草”記載并結(jié)合當時有關(guān)芝類圖對比，就會發(fā)現(xiàn)上述代表種中像云芝、硫黃多孔菌、苦白蹄、黑柄多孔菌均與有關(guān)圖不符。僅有赤芝、皺蓋假芝、紫靈芝比較接近有關(guān)的“六芝”圖。
宋代陳仁玉的《菌譜》所示黃芝圖與硫黃多孔菌形態(tài)比較，后者不屬于靈芝類�？喟滋闩c白芝、青芝和云芝形態(tài)相差甚遠，又不是同一科。巖崎園所著《本草圖譜》中的青芝圖屬典型的靈芝形狀，白芝和黃芝圖也是如此。隋代《太上靈寶芝品〉中所述赤玉芝、青玉芝、龜威芝、生金芝從圖所示，其形態(tài)均不屬于靈芝類，而是蘑菇及其他真菌，有的甚至是具有宗教色彩超自然的圖象。所以要想考證清楚“六芝”是比較困難的，有待進一步考究。
靈芝被視為瑞草
中國古人在認識和服食靈芝的過程中，肯定了靈芝的功效。在“本草”中記述“久食輕身不老”，說明靈芝具有扶正固本、促進身體健康的功效。在《漢武內(nèi)傳》中說靈芝是“太上之藥”，“得而食之，后天而老”，也說是長生不老。尤其在漢魏時期服食靈芝求延年益壽成了當時社會風尚，靈芝的功效也給人一種神秘感，使古人崇拜、信奉靈芝成其自然。靈芝的形態(tài)特征古樸典雅，野生量少，更顯得珍貴，古人又將靈芝以迷信色彩描述。把菌蓋表面的許多環(huán)形輪紋，稱做“瑞征”或“慶云”，視為吉祥如意的象征。靈芝成了祥瑞的化身，反映帝王德政和倫理道德的標志。于是上至皇帝，下至庶民把靈芝捧上了祥瑞的寶座。若能獲得靈芝便是一件值得慶賀的事。
據(jù)說漢武帝元封年間，甘泉宮年久失修，棟梁腐朽而滋生靈芝，大臣便借機歌頌皇帝的功德，說感動天地，使靈芝降生宮廷，祝萬事吉祥如意，皇帝萬壽無疆，因泰民安，皇帝自然大喜，便降旨于民眾每年向朝廷進貢靈芝。
宋代王安石在《芝閣賦》中記述了當朝逼迫民眾尋找靈芝的情景�！按蟪几F搜遠采，山農(nóng)野老攀援狙木弋 ，以上至不測之所不通，下溪澗壑谷，……人跡之所不通，往往求焉。”說明當時舉國上下到處搜尋靈芝瑞草，出現(xiàn)了“四方以芝來告者萬數(shù)”。據(jù)記載宋貞宗（1008）詔令全國進貢芝草，王欽進8193本，又從泰山采芝草3800本送到京城。丁謂向宋貞宗進獻芝草9500本，運芝者絡繹不絕。要收集如此多的野生靈芝，在交通發(fā)達的今天也是極不容易的。
黃庭堅上書朝廷建議廢除這種勞民傷財，坑害百姓而進貢靈芝的規(guī)定，卻無濟于事，進貢之事繼續(xù)到以后。元代永樂宮巨幅壁畫《朝元圖》則真實地記載了大臣、宮女進貢靈芝的壯觀場面。
中國古代將靈芝做為祥瑞之物或由靈芝所代表的一種精神信仰，或者倫理道德的標志，貫穿于中國封建社會，并影響到東鄰日本、朝鮮和東南亞地區(qū)，后來傳至西歐和美洲。在1979年英國出版的《蘑菇百科全書》（The Encyclopedia of Mushrooms）中以巨幅壁版面刊載了選自葛洪《抱樸子》中的一幅圖畫，反映了一位腰間絮帶靈芝瑞草而悠然自得的形象。
靈芝做為中國歷史上特有的祥瑞物，影響極為深遠和廣泛。而今在全國許多古剎寺廟、古建筑、亭臺樓閣、古典服飾、傳統(tǒng)生活用具，以及出土的大量文物，都能發(fā)現(xiàn)有關(guān)靈芝和“如意”的形象。佛教自唐朝由印度傳及中國后，古人按照當時的心愿，讓佛神手持靈芝如意。作者曾在香港中大崇基學院教堂發(fā)現(xiàn)一幅刺繡的圣經(jīng)掛圖，其中也繡了兩枚形態(tài)逼真的靈芝�？赡苷J為這些教派只有融匯了靈芝如意，才會達到完美、理想的精神境界。這可以說是東西方文化交流和相互影響，表現(xiàn)在靈芝方面的典型例證。
古代把靈芝類生物視為吉祥物，與當時缺乏自然科學知識有關(guān)，同時與宗教信仰的強大影響也是分不開的。尤其一些造詣不深的方士和本草家過高夸大靈芝的作用，又給靈芝蒙上了陰影，曾出現(xiàn)“黑芝賊”，“白芝喪”等令人厭惡之類的邪說。然而靈芝久經(jīng)考驗，不失其固有的高雅形象和藥用功效。特別是近數(shù)十年來在醫(yī)藥、保健、種類資源等方面受到國內(nèi)外科學家的高度重視，再次證明靈芝是中國之一寶，顯示出廣泛的應用潛力。
靈芝的化學成分
靈芝類所含化學成分復雜，且因所用菌種培養(yǎng)方法、提取方法等不同而異。研究靈芝類的化學成分的目的，在于了解和比較靈芝屬不同品種及同一品種的不同發(fā)育階段（如子實體、菌絲體、孢子體）所含的化學成分，通過藥理及臨床研究確定其有效成分或有效部分。為進一步研究靈芝藥理作用機制、提高臨床療效、改進生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制標準提供理論根據(jù)。目前研究較多的靈芝化學成分有：三萜類化合物、多糖類、核苷類、甾醇類、生物堿類、呋喃衍生物、氨基酸多肽類、無機元素、脂肪酸等。
第一節(jié) 三萜類化合物
三萜類化合物是靈芝的主要化學成分之一，靈芝中的很多三萜類化合物具有生理活性，如ganoderic acid A. B. C.和D能夠抑制小鼠肌肉細胞組胺的釋放。ganoderic acid F有很強的抑制血管緊張素酶的活性。赤芝孢子酸A對CCl4和半乳糖胺及丙酸桿菌造成的小鼠轉(zhuǎn)氮酶升高均有降低作用。赤芝孢子內(nèi)酯A具有降低膽固醇作用。因此對三萜類化合物的進一步深入研究將有利于靈芝有效成分的尋找和進一步闡明其生理活性。
1982年Kubota. T等人首次從赤芝子實體中分離得到三萜類化合物，此后十年來，對三萜類化合物研究最多的是日本，其次是中國（包括臺灣）。到目前為止已先后從赤芝子實體和孢子粉中分到了103種新的三萜類化學成分
一、三萜類化合物提取和分離
靈芝中三萜類化合物的提取分離方法可以分為三類，一類是用甲醇或者乙醇提取原料，提取物直接進行層析分離，如H. Konda等用甲醇提取原料，提取物濃縮后懸浮于水，依次用已烷、乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠色譜、高效液相層析（HPLC）分到四個三萜酸。第二類方法是用甲醇、乙醇等提取原料，然后分出總酸部分，進行分離，如Morigiwa等人用70%甲醇提取原料，提取物用1mol/L HCl調(diào)pH2~3，再用乙酸乙酯萃取，濃縮后進行分離，分到五個三萜類化合物。Nishitoba等人用乙醇提取原料，提取物濃縮后在水和CHCl3中進行分配，CHCl3層濃縮至一定體積后，用飽和的NaHCO3水溶液萃取，萃取物用6mol/L HCl酸化到pH3~4，水溶液中出現(xiàn)的沉淀以CHCl3溶解，干燥后得總酸提取物，經(jīng)硅膠柱層析分到五個三萜類化合物。第三類方法是利用制備衍生物的方法進行分離，如KiKuchi等用乙醚提取原料，其酸性部分用重氮甲烷進行甲基化，然后再在硅膠柱上進行分離，從中分到七個三萜酸。Hirotani等用90%MeOH-H2O提取，提取液減壓濃縮后加入5%Na2CO3水溶液堿化至pH9，然后用CHCl3萃取，水層用4mol/L H2SO4酸化至pH2，再用CHCl3萃取，CHCl3萃取液用水洗，Na2SO4干燥，濃縮后得總酸部分，該部分再以常規(guī)方法用重氮甲烷進行甲酯化，硅膠柱色譜，得到三個新的三萜酸。
靈芝中三萜化合物的分離大多是經(jīng)過反復硅膠柱層析，較純的部分薄層、低壓柱，高效液相色譜（正反相）制備等方法進行分離純化。硅膠柱色譜一般常用的展開劑為MeOH-CHCl3，EtAc-C6H6，EtoAc-acetone，EtOAc-CHCl3，CHCl3-MeOH-H2O等系統(tǒng)。HPLC多用乙腈—乙酸銨緩沖溶液以及MeOH-H2O洗脫。薄層檢查一般使用的展開劑為CHCl3-MeOH（95∶5，9∶1V/V）或苯—乙酸乙酯（3∶7V/V），香蘭醛-硫酸做為薄層斑點的顯色劑。
我們曾從赤芝孢子粉酸性脂溶部分中分到七個三萜類化合物，其中五個四環(huán)三萜酸，一個四環(huán)三萜醇，二個五環(huán)三萜內(nèi)酯化合物，并對它們的結(jié)構(gòu)進行了測定證明有三個新化合物，其余均為首次從赤芝孢子粉中分離出來。下面是三萜類化合物提取分離流程。
二、三萜類化合物的結(jié)構(gòu)測定
（一）三萜類化合物的結(jié)構(gòu)特點
靈芝三萜類化合物分為四環(huán)三萜和五環(huán)三萜。從靈芝四環(huán)三萜類化合物的結(jié)構(gòu)來看，屬于高度氧化的羊毛甾烷衍生物。按分子所含碳原子數(shù)可分為C30，C27和C24三大類，根據(jù)其所含功能團和不同的側(cè)鏈可有以下六種基本骨架。
在三萜酸的結(jié)構(gòu)中，環(huán)上的雙鍵大多位于△8（9）位，在C11位和C23位大部分有羰基，而且在C3、C7、C15位也多被羥基或羰基所取代。在三萜醇、醛和過氧化物的結(jié)構(gòu)中環(huán)上大多存在兩個不飽和雙鍵，其位置在△7（8），△9（11）位，C11位和C23位也不存在羰基而且環(huán)上的取代基明顯減少。表6-1列出了迄今為止分到的所有靈芝三萜化合物。目前靈芝三萜化合物的命名有些混亂，同一化合物有不同的名稱，對此我們采用最早的命名。
（二）三萜類化合物的光譜特征
1.紅外光譜:靈芝中的三萜類化合物大多都有羥基,因而在3300cm-1，1050cm-1有強的羥基吸收峰。三萜酸類化合物在2600～2400cm-1有弱吸收峰，當羧酸被酯化以后這一吸收峰消失。在C15位有羰基的化合物在1740～1760cm-1會出現(xiàn)五元環(huán)酮的吸收特征峰。在1720cm-1（酯），1710cm-1（六元環(huán)酮），1650cm-1（α、β不飽和酮）也有較強的吸收峰。
2.紫外光譜：由于靈芝中的三萜類化合物大多都有共軛體系存在，因而紫外吸收波長和強度也很有規(guī)律，凡在C11位存在羰基的化合物都存在著△8（9）雙鍵，這類化合物的紫外吸收大多在λmax253nm，logε在3.8～4.1之間，而C11位沒有羰基的化合物，大多存在著△7（8）、△9（11）共軛雙鍵，因而紫外吸收在λmax237nm，244nm，253nm有三個吸收峰，而吸收強度大多在logε3.7～4.1之間。而在既沒有α、β不飽和酮，又沒有共軛雙鍵的化合物中，紫外光譜僅表現(xiàn)簡單的雙鍵末端吸收在λmax210nm logε4.2左右。
3.質(zhì)譜：四環(huán)三萜化合物質(zhì)譜裂解的共同特征是失去側(cè)鍵。羊毛甾烷類的特征裂解是從D環(huán)斷裂，伴有一個質(zhì)子的轉(zhuǎn)移，然后經(jīng)第二次裂解失去側(cè)鏈和D環(huán)的一部分。Kikuchi[11] 在這方面作了很多研究，總結(jié)出這類化合物的裂解方式大致如下：
4.核磁共振譜：三萜類化合物的1HNMR中主要信號是雙鍵質(zhì)子，連氧碳質(zhì)子和甲基質(zhì)子（見表6-2）。環(huán)內(nèi)雙鍵質(zhì)子的δ值一般大于5×10-6，在靈芝三萜化合物中，如ganoderic acid R. S. T. X. Y. Me等的雙鍵位置在△7（8）和△9（11），7位質(zhì)子的δ值在（5.48～5.86)×10-6之間,11位質(zhì)子的δ值比7位要處于高場,在δ(5.31～5.39）×10-6之間，側(cè)鏈上雙鍵的位置可分為二類，一類在△20（22），20位質(zhì)子的信號在δ（6.04～6.12)×10-6，如ganoderenic acid A.B.C.D等。另一類在△24（25），24位質(zhì)子的信號在δ（5.4～5.7）×10-6，如ganoderol A和B。
連氧碳質(zhì)子由于位置、環(huán)境和構(gòu)型的不同，其化學位移變化較大。在C3、C7、C12、C15為羥基取代的化合物中由于羥基構(gòu)型不同，該碳所連接H的化學位移值和偶合常數(shù)也不同，3—H多為α構(gòu)型，δ值在(3.22～3.31)×10-6，J=10Hz，7—H為α構(gòu)型時δ：（4.75～4.85)×10-6，J=9Hz，7—H為β構(gòu)型時，δ：（4.4～4.5)×10-6，J=5Hz。12—H多為α構(gòu)型，δ：（4.5～4.9)×10-6。15—H多為β構(gòu)型，δ（4.2～4.90)×10-6。三萜中的甲基信號上有較多的取代基，對甲基的化學位移影響較大。18—CH3通常在δ（0.95～1.0)×10-6之間，當分子中存在△7（8）、△9（11）共軛雙鍵時，該甲基信號向高場位移至δ（0.55～0.60)×10-6，當12位有羥基取代時，該信號出現(xiàn)在δ0.85×10-6左右。21—CH3信號通常出現(xiàn)在δ（0.85～1.0）×10-6之間，為雙峰，但當20位有羥基取代時，該信號向低場位移，出現(xiàn)在δ（1.4～1.6）×10-6，當存在△20（22）雙鍵時，該信號出現(xiàn)在δ2.1×10-6，且都為單峰。27—CH3通常出現(xiàn)在δ（1.1～1.2）×10-6，當存在△24（25）雙鍵時，該甲基信號在δ1.6×10-6左右。32—CH3受7位和15位取代基的影響較大。當7位和15位同時被羰基取代時，該號在δ（1.6～1.8）×10-6之間，當7位和15位均為羥基或一個羥基一個羰基時則無明顯變化均出現(xiàn)在δ（1.2～1.3）×10-6之間，當7位和15位無取代基時，該甲基信號則出現(xiàn)在δ0.88×10-6左右。30—CH3和31—CH3受3位取代基影響較大，當3位是羥基時30—CH3在δ1.0×10-6左右，31—CH3在δ0.85×10-6左右。當3位是羰基時，17—H在δ1.8×10-6左右，而當15位是羰基時17—H向低場移至δ2.2×10-6左右。從17—H的位置可以判斷C15位所連接的基團。
13CNMR的運用使得化合物基本骨架的確定日趨準確。三萜化合物的碳譜中最容易分辨的信號來自雙鍵碳原子和連氧碳原子。前面提過靈芝三萜母核上的雙鍵位置有兩類，在△8（9）這類化合物中，C8在δ（151～160）×10-6，C9在δ（140～146）×10-6，在△7（8）和△9（11）這類化合物中C7在δ（120～121）×10-6，C8在δ（140～142）×10-6，C9在δ（141～145）×10-6，C11在δ（115～117）×10-6。側(cè)鏈上的雙鍵位置也有兩類，一類是△20（22），C20在δ（154～157）×10-6，C22在δ（124.3～124.7）×10-6；另一類是△24（25），C24在δ（139～145）×10-6，C25在δ（126～129）×10-6。當下列各碳連有羥基時，它們的化學位移值分別為C3δ（77～79）×10-6，C7δ（66～68）×10-6，C12δ（77～79）×10-6，C15δ（72～74）×10-6。當下列各碳連有羰基時，它們的化學位移值分別為C3δ（215～216）×10-6，C7δ（198～200）×10-6，C15δ（205～217）×10-6，C23δ（207～208）×10-6。羧酸酯的化學位移在δ（170～178）×10-6。C3、C7、C15取代基不同時，C1在δ（35～37）×10-6，C2在δ（34.1～34.8）×10-6，C4在δ（46～47）×10-6，當C3連接的是羥基時，這三個碳的信號均向高場位移，C1在δ34×10-6，C2δ27×10-6，C4δ38×10-6左右。C7是羰基取代時C6在δ（33～37）×10-6，C7是羥基取代時C6在δ（26～28）×10-6。C15是羰基時C14在δ（57～59）×10-6，C15是羥基時，C14在δ（52～53）×10-6。
近年來發(fā)展起來的1H—1H和1H—13C COSY等二維核磁共振譜已應用在靈芝三萜結(jié)構(gòu)的測定中。
5.旋光光譜：旋光光譜主要是解決絕對構(gòu)型問題，從文獻報道的CD譜數(shù)據(jù)總結(jié)出CD譜與絕對構(gòu)型關(guān)系；凡是具有[I]式絕對構(gòu)型者，C7為羥基，不管3位或15位是羥基或羰基取代，CD譜都呈現(xiàn)下列Cotton效應，（290～295）nm（—），（248～257）nm（+），（207～217）nm（—）；凡是在[I]式結(jié)構(gòu)中C7為酮基者，則不管3位或15位的取代基如何，都呈現(xiàn)如下Cotton效應：（305～307）nm（—），（272～278）nm（+），（253～256）nm（—），（225～231）nm（+）。
Nishitoba等人在鑒定epoxyganoderiol A的絕對構(gòu)型時，應用CD譜確定了C24和C25的絕對構(gòu)型。在epoxyganoderiol A的側(cè)鏈上存在著一個環(huán)氧基團，為了確定24和25位是S還是R，首先以羊毛甾醇為原料，經(jīng)反應得到S和R兩種構(gòu)型的化合物，反應如下：
a)AC2O/pyridine, b) SeO2/dioxane, c) NaBH4/CeCl3·7H2O/MeOH-THF
d)(+)-DETor (-) -DET/Ti (O1Pr) 4/TBHP/CH2Cl2
分別將7b和7a溶于CCl4溶液中，加入Eu（fod）3絡合物，測其旋光譜，得到如下結(jié)果：
以上兩個化合物的CD譜的Cotton效應是與C25的Newman投影相一致的。正Cotton效應為25S負Cotton效應為25R。在相同條件下測epoxyganoderiol A的CD譜，顯示313nm（△ε+10.9）為正Cotton效應，證明25位的絕對構(gòu)型為S，通過測定NOE，證實24位絕對構(gòu)型為S。
（三）結(jié)構(gòu)測定中的化學反應
隨著儀器分析新技術(shù)、新方法的發(fā)展，各類譜學方法和X射線—衍射等分析手段已在結(jié)構(gòu)測定中得到了廣泛的應用。經(jīng)典的化學方法與儀器分析相結(jié)合，使三萜化合物的結(jié)構(gòu)測定快速而準確并達到了微量的水平�；瘜W反應常用于證實分子骨架中取代基類型、數(shù)目、位置及構(gòu)型等。
1.氧化反應 氧化反應主要用來確定分子中所含羥基、羰基或�；臄�(shù)目和位置等。應用較多的是將羥基氧化成羰基，比較常用的是鉻酐—吡啶的方法，也有將鉻酐溶于AcOH中攪拌加入樣品中，室溫下攪拌2h，用水稀釋，氯仿提取，提取液經(jīng)水洗干燥濃縮后經(jīng)薄層制備而得到氧化產(chǎn)物。
2.酰化反應 �；磻獙τ诖_定分子中羥基的數(shù)目、性質(zhì)、構(gòu)型很有幫助，常用的乙�；磻�，通常采用醋酐—吡啶室溫處理的方法。
3.水解 由于部分靈芝三萜酸中帶有乙�；�，為確定乙�；拇嬖诤蛿�(shù)目，采用了水解的方法，如Komoda將ganoderic acid F溶于甲醇，用5%Na2CO3室溫處理3h后，用2mol/L HCl酸化，除去甲醇后用CHCl3萃取，水洗CHCl3液后Na2SO4干燥，蒸干。通過TLC制備得水解產(chǎn)物。
4.還原 還原反應主要用來確定分子中有無不飽和雙鍵及羥基、羰基、取代基的位置。如Nishitoba等人在確定lucidenato G結(jié)構(gòu)時，為了證實C26位上存在著羥基，先將lucidenate G甲基化，然后再用NaBH4進行還原，得到其丙酮化物，從而證實了C26位存在著一個羥基。
第二節(jié) 多糖類化合物
多糖類化合物是靈芝所含化學成分之一，現(xiàn)已證明，靈芝多糖類具有抗腫瘤作用、免疫調(diào)節(jié)作用、降血糖作用、降血脂作用、抗氧化作用和抗衰老作用，故靈芝多糖類是靈芝的主要有效成分。臨床試驗也證實，靈芝多糖可作為腫瘤化學治療和放射治療的有效輔助治療藥。有關(guān)靈芝多糖類的分離、純化、結(jié)構(gòu)確證的研究方興未艾，迄今仍為國內(nèi)外矚目的重要課題。
一、靈芝多糖類的分離、純化及鑒定
靈芝多糖類的分離、純化及結(jié)構(gòu)確證的方法及步驟可概括如下：多采用熱水提取、分部沉淀的方式分離靈芝的多糖組分；進一步經(jīng)各種層析如DEAE纖維素柱色譜、Sephadex G75柱色譜，凝膠過濾如Sepharose CL—4B凝膠過濾，高壓電泳和聚丙酰胺凝膠電泳等處理可獲純化的多糖；后者經(jīng)酸水解、紙色譜、氣相色譜分析可確定其單糖組分，經(jīng)酶水解可檢測殊碳糖（anomeric）結(jié)構(gòu)；經(jīng)甲基化技術(shù)及Smith降解、氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用、紫外及紅外光譜分析、核磁共振等可確定多糖的連接方式和基本化學結(jié)構(gòu)。多糖的分子量可通過凝膠柱色譜如SephadeaxG—100柱色譜、超離心測沉降系數(shù)等方法測定，一般在測得分子量范圍后，求出平均分子量。
二、靈芝多糖類的理化特性
由于靈芝的種類、產(chǎn)地、分離提取方法各異，所獲靈芝多糖的理化特性、分子量、單糖組分和連接方式不同，生物活性亦有差異。如Hiroshi等（1985）報道，赤芝子實體熱水提取物經(jīng)濃縮、透析及系列色譜后獲得兩種多糖ganoderan A和B。ganoderan A的分子量9 300，旋光度[α]D+58.8°，ganoderan B分子量3 600，旋光度[α]+33.3°，二者對小鼠均具降血糖作用。隨后，他們又從赤芝子實體中分離出兩個降血糖有效成分ganoderan B和C，均為糖肽，分子量分別為7 400和5 800。物理化學和化學研究證明，ganoderan B含吡喃葡萄糖�；�-1→3主鏈和β-1→6側(cè)鏈，ganoderan C則含D-吡喃葡萄糖�；�-1→3和β-1→6連接和D-吡喃半乳糖酰基α-1→6連接。Mizuno等（1986）報告，赤芝子實體經(jīng)85%乙醇（80℃），熱水（100℃），3%草酸銨（100℃）和5%氫氧化鈉（30℃）提取后，殘渣再用5%氫氧化鈉（含0.1%硼氫化鈉，80℃），20%氫氧化鈉（含0.1%硼氫化鈉，30℃）和5%氯化鋰（溶于二甲醋酸銨中，70℃）提取，獲多糖組分A、B、C。A和B經(jīng)乙醇分離，醋酸沉淀，Sepharose CL-4B凝膠過濾，得4個β-葡聚糖，其中I和II來自A，III和IV來自B。從C分離出脫乙酰殼多糖（chitosan）（V）。I—V經(jīng)80%甲酸（85℃）處理可獲相應的甲酰化多糖和低分子量多糖。I—IV主要由葡萄糖和少量的糖醛酸、木糖、甘露糖組成，并具β-（1→3）-D-葡聚糖主鏈和β-（1→6）葡萄糖基側(cè)鏈，其分子量分別為330 000、60 000、160 000和110 000。不同之處是IV不含木糖，但含1.2%蛋白質(zhì)。V經(jīng)酸水解后，主要含葡萄糖胺，并含少量葡萄糖，經(jīng)紅外光譜和X射線分析證明為脫乙酰殼多糖。給小鼠腹腔注射II、III以及III的甲酸酯和I～IV的低分子量多糖均具有宿主中介性的抗腫瘤活性，半數(shù)抑瘤量（ID50）分別為42.5mg/kg、34.1mg/kg、70.2mg/kg、22.4mg/kg、17.0mg/kg、32.1mg/kg和25.8mg/kg。Mizuno等（1985）報告，赤芝子實體經(jīng)水提取后，其殘渣經(jīng)3%草酸銨溶液（100℃）和5%氫氧化鈉溶液（30℃）提取后，得2個水不溶多糖A和B。A經(jīng)真空濃縮、透析、凍干，Shepharose CL-48凝膠過濾，獲主要組分C。B用醋酸中和至pH5～6，得酸性異多糖D，加乙醇沉淀得糖蛋白E和另一種異多糖。C由酸性β-D-葡聚糖構(gòu)成，含葡萄糖77%、葡萄糖醛酸10.3%以及少量的果糖、木糖、甘露糖和半乳糖，分子量10 000～30 000。D的分離程序同A，它含兩個主要成分G和H，G和H均為酸性異多糖，分別含葡萄糖92%和95%，葡糖醛酸9.7%和13.0%以及少量果糖、木糖、甘露糖、乳糖，分子量70 000～100 000。給小鼠腹腔注射A—H對S180均具有抗腫瘤活性，50%抑瘤量為（6.3～26.3)mg/kg，但口服無效。1989～1994李榮芷、何云慶等先后報告，赤芝子實體經(jīng)熱水提取，乙醇分部沉淀、透析、除蛋白等步驟得靈芝多糖BN3A、BN3B、BN3C和GL-A、GL-B、GL-C。進一步經(jīng)DEAE纖維素柱色譜分離，酶解，酸水解，過碘酸氧化，甲酸生成，Smith降解、氣相色譜、高壓液相色譜分析和光譜分析等從BN3B、BN3C、GL-A、GL-B和GL-C共分離鑒定了18個靈芝多糖均一體，其中5個肽多糖、4個葡聚糖，其余為雜多糖，其化學結(jié)構(gòu)及分子量見表6-4。
表6-4 靈芝多糖的化學結(jié)構(gòu)和分子量
均一體
化學結(jié)構(gòu)
分子量
BN3B
BN3B1
β（1→6）β（1→3）
葡聚糖
3.50×104
BN3B2
β（1→6）β（1→3）
阿拉伯半乳聚糖
4.00×104
BN3C
BN3C1
β（1→6）β（1→3）
葡聚糖
1.62×104
BN3C2
β（1→6）β（1→3）
肽多糖
2.45×104
GLA
GLA2
肽多糖
0.93×104
GLA4
均以β（1→3）為主
雜多糖
1.33×104
GLA6
含少量β（1→6）及β（1→4）
肽多糖
1.28×104
GLA7
以半乳糖、葡萄糖為主
雜多糖
1.20×104
GLA8
肽多糖
1.48×104
GLB
GLB2
β（1→4）為主，尚有β（1→6）
葡聚糖
0.71×104
GLB3
β（1→4）為主，極少β（1→6）
甘露葡聚糖
0.77×104
GLB4
β（1→4）
雜多糖
0.90×104
GLB6
β（1→4）含乙�；�
雜多糖
0.88×104
GLB7
β（1→4）為主，尚有β（1→6）
雜多糖
0.90×104
GLB9
β（1→4）為主
半乳葡聚糖
0.93×104
GLB10
β（1→4）β（1→6）含乙酰基
雜多糖
0.68×104
GLC
GLC1
β（1→4）少量β（1→6）
肽多糖
0.57×104
GLC2
β（1→4）少量β（1→6）含乙酰基
葡聚糖
0.60×104
Mizuno等（1982）經(jīng)熱水提取，乙醇分部沉淀，并經(jīng)離子交換色譜，pH依賴的Cetavlon處理、凝膠過濾以及Con A-Sepharose GL-4B親和色譜等純化，從人工培養(yǎng)的平蓋靈芝菌絲體中得到一個多糖組分。進一步通過甲基化、核磁共振、過碘酸氧化、Smith降解和β-D-葡聚糖酶（β-D-glucanase）分解等技術(shù)研究多糖的化學結(jié)構(gòu)。α-葡聚糖組分具有α（1→4）葡萄糖苷主鏈，主鏈上每9～12個殘基連接α（1→6）支鏈，該組分僅有微弱抗腫瘤活性。β-葡聚糖組分具有β（1→3）葡萄糖苷主鏈，主鏈上每12個殘基通過β（1→6）連接一個單糖苷支鏈。其中之一顯示顯著的抗小鼠S180活性，50%抑瘤劑量為0.74mg/kg。
Mizuno和Miyasaki等分別從赤芝、平蓋靈芝和紫芝加哥提取出具有抗腫瘤活性的多糖。并確證其基本化學結(jié)構(gòu)。
就抗腫瘤活性而言，靈芝多糖并無種間差異，它們和從其他真菌中所獲多糖一樣，具有以下三個特性：
1.初級結(jié)構(gòu)的分子量在3×105以上。
2.多聚物的連接方式均有β-1-3-D-殘基的主鏈和β-1-6-D-葡萄糖側(cè)鏈殘基。但從不同真菌提取的多糖的β-1-6-D-葡萄糖的分支程度不等，靈芝多糖的主鏈殘基與側(cè)鏈殘基的比例為5∶2，即每個主鏈殘基環(huán)繞2個β-1-6-D-葡萄糖殘基。無1-6β側(cè)鏈的1-3-β葡聚糖未見抗腫瘤活性。
3.多糖的三維螺旋結(jié)構(gòu)參與其抗腫瘤活性，此結(jié)構(gòu)遭破壞則影響其活性。
第三節(jié) 靈芝的其他化學成分
靈芝除了含有多糖和三萜類化學成分以外，還含有核苷類、甾醇類、生物堿類、氨基酸多肽類和呋喃衍生物等化學成分。
一、核苷類
核苷類是具有廣泛生理活性的一類水溶性成分，余競光等從薄蓋靈芝菌絲體中分離得到五種核苷類化學成分，其中靈芝嘌呤是新化合物。Shimiz等人從赤芝子實體中也得到四種核苷類化合物。靈芝中核苷類化合物的提取方法一般是將靈芝菌絲體乙醇提取物濃縮后溶于水，依次以乙醚、乙酸乙酯萃取，萃 取后的水溶液通過陽離子樹脂處理，流出的溶液及水洗液通過大孔樹脂色譜，得到尿嘧啶核苷、尿嘧啶。交換后的陽離子樹脂用NH4OH處理，依次用乙醇、水洗脫。95%乙醇洗脫部分經(jīng)硅膠柱色譜及制備薄層色譜得到腺嘌呤、腺嘌呤核苷和靈芝嘌呤等。這幾種核苷類的結(jié)構(gòu)如下：
由赤芝孢子粉和薄蓋靈芝菌絲體制成的增肌注射液在臨床上廣泛應用于進行性肌營養(yǎng)不良，萎縮性肌強直等疾病的治療，并有較好的療效。動物實驗證明尿嘧啶和尿嘧啶核苷對實驗性肌強直癥小鼠血清醛縮酶有降低作用。SHimizu等人發(fā)現(xiàn)腺嘌呤核苷有很強的抑制血小板凝集血小板凝聚的作用和鎮(zhèn)靜、抗缺氧及促進心肌組織攝取86Rb的作用。
二、甾醇類
靈芝中甾醇含量比較高，僅麥角甾醇含量就達千分之三左右。已知從靈芝中分到的甾醇有近二十種，其骨架分為麥角甾醇類和膽甾醇類兩種類型，甾醇類化合物有麥角甾醇（ergosterol），麥角甾醇棕櫚酸酯（ergosta-palmitate）；麥角甾-7，22-二烯-3-酮（ergosta-7,22-dien-3-one）；羊毛甾-7，9（11），24-三烯-3β，21-二醇（lanosta-7,9(11),24-trien-3β,21-diol）；麥角甾-7，22-二烯-3β-醇（ergosta-7,22-dien-3β-ol）；5α-豆甾烷-3.6-二酮（5α-stigrmastan-3.6-dione）；β-谷甾醇（β-sitosterol）；24-甲基膽甾-7-烯-3β-醇[（24s）-24-methyl-5α-cholest-7-en-3β-ol]；麥角甾4.6,8(14),22-四烯-3酮（ergos-ta-4,6,8(14),22-tetra-en-3-one）;24(s)-24—甲基5α-膽甾-7，16-二烯-3β-醇，[(24s)-24-methyl-5α-cholest-7,16-dien-3β-ol]；異麥角甾酮（iso-ergosteion)；以及麥角甾醇過氧化物（ergosterol peroxide),ergosta-7,22-dien-3β-yl linoleate,5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-yl lionleate,ergosta-7,22-dien-2β,3α,9α-triol等。
甾醇類化合物的提取分離多以乙醇提取原料，然后用乙醚萃取，再用NaHCO3水溶液萃取乙醚溶液，除去酸性部分，然后用硅膠柱層析分離甾醇類化合物，甾醇類化合物的生理活性報道很少。
三、生物堿類
靈芝中的生物堿含量比較低，僅從野生靈芝、赤芝孢子粉、薄蓋靈芝中分到過生物堿，有膽堿（choline）；甜菜堿（betains）及其鹽酸鹽γ-三甲胺基丁酸（γ-butyrobetaine），靈芝堿甲（ganoine,I），靈芝堿乙（ganodine,II）。
靈芝生物堿的分離一般是用乙醇和水相繼提取，提取物經(jīng)乙醚脫脂，水溶部分采用雷氏鹽沉淀法或樹脂法得到含氮部分，再經(jīng)薄層色譜和制備薄層色譜得到單體生物堿。
靈芝中生物堿雖然含量較低，但有些具有一定的生物活性，γ-三甲胺基丁酸在窒息性缺氧模型中有提高存活時間的作用，以及能使離體豚鼠心臟冠脈流量增加。甜菜堿臨床上將其和N-脒基甘氨酸（glycocyamine）共用以治療肌無力[18]。
四、呋喃衍生物
靈芝中的呋喃衍生物類是從發(fā)酵的薄蓋靈芝菌絲體乙醇提取物乙酸乙酯溶解部分經(jīng)硅膠柱色譜得到的，有以下幾種化合物，并未見生理活性的報道。
1.R=CH2OH(5-羥甲基呋喃甲醛) 1,1′=α-糠醛基二甲醚
2.R=CH2OCOCH3(5-乙酰氧甲基呋喃甲醛)
3.R=CH2OC4H9(5-丁氧甲基呋喃甲醛)
五、氨基酸多肽類
靈芝中的氨基酸有天門冬氮酸、谷氨酸、精氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、γ-丁基氨酸等，并發(fā)現(xiàn)有含硫氨基酸，其結(jié)構(gòu)經(jīng)X-衍射分析確定為硫組氨酸甲基內(nèi)銨鹽。其結(jié)構(gòu)如下：
實驗證明天門冬氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、酪氨酸、精氨酸、賴氨酸、亮氨酸、丙氨酸等可以提高小鼠窒息性缺氧的存活時間。
從靈芝中還分到多肽類化合物，其中有兩種中性多肽，一種水解后鑒定含有亮氨酸、酪氨酸、纈氨酸、脯氨到、丙氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸等八種氨基酸；另一種多肽可使小鼠窒息性缺氧的存活時間由21min50s提高到45min47s。水解后鑒定含有苯丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬氨酸等。分離到的酸性多肽經(jīng)水解得到十一種氨基酸，堿性多肽經(jīng)水解得到四種氨基酸，初步確定氨基酸排列次序是鳥氨酸—甘氨酸—脯氨酸—脯四肽。
氨基酸的分離采用色譜、電泳雙向色譜等方法，與已知品對照，茚三酮顯色，進行鑒定，近年來儀器的發(fā)展使得氨基酸分析更現(xiàn)代化，用氨基酸分析儀即可得到各種氨基酸的數(shù)量和含量。肽的鑒別是靠高壓電泳及雙向色譜方法。
六、無機元素
靈芝中含有多種微量元素，有Mn，mg，Ca，Cu，Ce，Sr，Ba，Zn，F(xiàn)e，P，B，Cr，Ni，V，Ti等，靈芝的鍺（Ge）含量與一般植物相似，但它對鍺的富集能力比較強，很多研究者將無機鍺加入靈芝培養(yǎng)基（液）中以得到較高含量的有機鍺。鍺并非靈芝的主要有效成分。
七、其他
從靈芝中還得到一些脂肪酸、長鏈烷烴等，有苯甲酸、硬脂酸、棕櫚酸、十九烷酸、廿二烷酸、廿四烷酸、卅一烷、廿四烷，還有甘露醇、海藻糖、煙酸等。
關(guān)于靈芝及其制劑的質(zhì)量控制問題。
靈芝及其制劑在臨床上應用比較多，其質(zhì)量控制問題一直是許多生產(chǎn)廠家和科研工作者研究的課題，但在這方面的報道并不多，根據(jù)我們多年對靈芝的研究的經(jīng)驗，認為應以多糖和三萜的含量做為栽培和野生靈芝的質(zhì)量控制標準，這是因為靈芝含有較多的多糖，而且這些多糖大多具有提高免疫功能的作用，這與靈芝滋補強壯、扶正固本的作用是一致的。靈芝中含量比較高的另一類成分是三萜，而且一些三萜化合物已在幾個方面表現(xiàn)比較強的生理活性，因此三萜含量的測定可以作為靈芝的質(zhì)量控制標準之一。
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